在PCR反應中，將待擴增的DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸(dNTPs)和DNA聚合酶等成分加入96孔反應板的每個孔中，然后放入96孔PCR儀中，按照預設的程序，依次在高溫下使DNA變性解鏈為單鏈，在較低溫度下引物與模板DNA結合(退火)，再在適宜溫度下DNA聚合酶催化引物延伸合成新的DNA鏈。經過多次循環，目標DNA片段的數量呈指數級增長。
 

　　除了常規PCR的基本原理外，實時熒光定量PCR儀在反應體系中加入了熒光基團。在PCR擴增過程中，熒光基團的信號強度與PCR產物的數量成正比。通過熒光檢測系統實時監測熒光信號的變化，就可以對目標基因進行定量分析。
 

　　96孔PCR儀的測定步驟：
 

　　1.實驗準備
 

　　-試劑與樣品準備：準備好PCR反應所需的各種試劑，如DNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等，并確保其質量和純度符合實驗要求。根據實驗設計，準確計算和配制反應體系，可進行預實驗以優化反應條件。
 

　　-器材準備：準備好干凈的光學級封板膜、移液器及配套的吸頭等。確保PCR板無劃痕、無污染，封板膜密封性良好。
 

　　2.加樣
 

　　-加樣操作：將配制好的PCR反應體系依次加入96孔PCR板的各孔中，注意移液器的使用技巧，避免氣泡產生，并確保每個孔中的樣品和試劑量準確且一致。在加樣過程中，要嚴格遵循無菌操作原則，避免交叉污染，每次更換樣品或試劑時都要更換移液器的吸頭。
 

　　-封板：加樣完成后，用光學級封板膜將PCR板密封好，防止PCR過程中的蒸發和污染，確保每個孔中的反應體系在相同的條件下進行。封板時要注意撫平封板膜，避免產生氣泡，影響熒光信號的檢測。
 

　　3.放置樣品：將密封好的96孔PCR板輕輕放入PCR儀的加熱孔中，確保PCR板與儀器的接觸良好，位置擺放正確。
 

　　4.設置程序：打開PCR儀的電源和配套的軟件，根據實驗要求設置熱循環程序文件，包括預變性溫度、時間，變性溫度、時間，退火溫度、時間，延伸溫度、時間以及循環次數等參數。同時，設置反應板文件，對各孔進行標注，以便區分不同的樣品。